CDE老师文章解读 | 关于抗体偶联药物生物分析策略及技术要点的若干考虑

生物样品分析对象：

ADC生物分析需重点定量总抗体、ADC、游离载荷及DAR值，并检测抗药抗体及开展放射性/药效学研究。

生物样品分析：

需根据研发阶段（临床前全面检测、早期临床充分表征、后期经评估可简化）和特殊人群研究，重点检测总抗体、ADC、游离载荷及代谢物、DAR值等，游离载荷数据尤为关键，特殊情况需提供依据。

DAR值：

采用HIC-UV、LC-MS/MS或LC-HRMS等方法测定DAR值及DAR值分布。

小分子载荷：

需分析方法足够灵敏，一般采用LC-MS/MS法结合型载荷、游离型载荷以及载荷相关代谢产物。

总抗体及ADC：

采用较多的分析方法为ELISA和LC-MS方法。

免疫原性：

常用ELISA、MSD测定抗药抗体及中和抗体。

摘要

抗体偶联药物（ADC）结构复杂，且结构与作用机制相关，体内作用过程中存在多种机制相关的形式，并且可能发生时间/过程依赖性变化，因此药动学研究难度大。此外，小分子载荷的毒性较大，应特别关注脱靶、非预期释放或者代谢导致的风险或影响。采用恰当、准确可靠的分析方法表征ADC及各组成部分的药动学行为对ADC药物研究至关重要。结合ADC 药物的偶联结构特点，介绍ADC药物中ADC、抗体或抗体片段、连接子和载荷等各种成分生物分析的策略及技术要点，旨在为ADC药物以及其他偶联药物的研究和研发提供一定参考。

关键词

抗体偶联药物（ADC）是一类由抗体或抗体片段、连接子和载荷组成的靶向生物药物。其结构为采用特定的连接子将靶标特异性的抗体与小分子药物（即载荷，如高杀伤性的细胞毒性药物）偶联起来^[1-6]，通常抗体或抗体片段（下文统称抗体）发挥靶向特异性，载荷发挥药效如肿瘤杀伤作用；有些情况下抗体也可发挥药效作用。载荷通常为相对分子质量小、药效强、血浆半衰期短的小分子化学药物，如微管抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、免疫调节剂等。

ADC结合了靶组织的特异性和选择性，表现出较好的临床疗效和相对较好的安全性。自2000年首款ADC药物Mylotarg（吉妥珠单抗奥佐加霉素）获FDA批准以来^[7]，截至目前，全球已有19种ADC药物获批上市，主要用于治疗血液恶性肿瘤和实体瘤等^[7-10]。随着抗体药物的发展、偶联技术的进步、生产工艺的不断完善等，ADC疗效和应用不断得到拓展，研发的积极性持续高涨。目前超过400种ADC药物正处于不同的研发阶段，多款ADC药物已申报上市或正在开展临床研究。

ADC偶联结构复杂，进入体内后在发挥作用过程中可能存在多种机制相关的形式，如ADC、游离抗体、游离载荷、连接子-载荷等，并且上述存在形式可能发生时间/过程依赖性的变化，因此ADC的药动学研究难度大，采用恰当、准确可靠的分析方法良好表征ADC及各组成部分，提供充分的药动学关键信息对ADC药物的研发至关重要^[11-17]。

在ADC体内的多种存在形式中，小分子载荷的毒性较大，脱靶、非预期释放或者代谢导致的风险或影响值得关注，建议在整个研发过程中均予以关注，给予充分表征和分析。

ADC生物样品分析的对象可概括为3个方面：（1）ADC相关成分的定量分析：ADC药物在生物样品分析中其存在形式通常包括ADC、抗体或抗体片段、连接子和载荷以及载荷相关代谢产物。考虑作用机制相关性、生物分析方法等因素，通常可考虑测定总抗体（包括ADC中的抗体以及游离/非偶联抗体）、ADC、游离载荷、载荷相关代谢产物。还可以基于上述成分的定量分析结果来描述药物-抗体比（DAR）值。ADC的DAR值及DAR值分布甚至体内外DAR值的变化对其安全性和有效性都有重要影响，应关注并加以表征^[2]。ADC及相关组成成分的定量是ADC研发过程中生物样品分析的重点，为临床研发策略及给药方案的制定提供必要和关键信息，本部分内容亦是ADC上市注册申报资料中必要的组成部分，本文将重点对此部分内容进行阐述。（2）抗药抗体的分析：包括ADC的抗药抗体及中和抗体测定，以表征ADC的免疫原性^[11,15]。（3）其他：在非临床研究阶段，往往还会开展放射性标记的物质平衡研究，获得其组织分布及代谢等结果^[2-3,12]。在非临床研究和临床试验阶段，开展必要的药效学研究，描述其作用机制及药效学结果。组织分布及相关药效学指标、生物标志物等需要准确定量。

在药物研发的各个阶段，由于研究目的和研究基础不同，生物样品分析的策略、重点和难点可能有所不同^[13-15]。

在药物研发初期，需充分关注血浆/血清中ADC及各组成成分的定量分析，DAR值及DAR值分布/变化亦为研究重点^[2-3]，可为ADC的安全性和有效性提供重要信息。

临床前研究阶段是在动物体内对药物安全性和药理药效的初步探索阶段，研究基础较弱，所需获取的信息较多，因此涉及的分析方法最多。一般需全面关注ADC相关成分的定量分析，包括总抗体、ADC、偶联状态载荷、游离载荷、代谢物等。并基于上述成分的定量分析大致描述ADC的DAR值及DAR值分布，表征ADC的药动学，并充分关注小分子载荷的释放及代谢研究。

在临床试验阶段，从首次人体研究开始至临床研发后期，理想状况下，应检测并获得ADC、抗体、载荷及药理学活性代谢物的数据，获得上述成分在一定剂量范围内的药动学特征，药物的药效/疗效以及安全性表现。基于上述数据开展充分的暴露-有效性、暴露-安全性关系分析，从而为后续研究的剂量选择提供依据^[1-3]。早期研究中应充分获得ADC及其组成部分的数据并能清晰阐明其中规律，如早期临床试验的药动学特征应充分表征总抗体和ADC浓度之间的相关性、游离载荷及药理学活性代谢物的全身暴露量。

理想情况下，ADC中的载荷跟随抗体部分到达靶部位，抗体与其靶抗原结合后，通过内吞作用等作用机制，将有效载荷暴露于细胞内靶标，特异性发挥药效，从而降低全身非靶部位的暴露和毒性。但由于各种原因，载荷不可避免地会发生非预期解离或脱落，产生游离载荷，对安全性产生影响，故应关注。通常情况下，游离载荷的数据关系到药物的安全性信息，为必要的数据基础。极特殊情况下，如游离载荷浓度较低，无法通过具有足够灵敏度的分析方法实现有效测定，应在注册申报资料中充分提供游离载荷无有效定量检测结果的依据和证据，并对上述情况的影响进行评估。

若前期已获得充分的研究基础，如非临床药理学数据、早期临床药动学及安全性数据可充分阐述ADC的作用机制、非偶联抗体的药理学活性、代谢物的药理学活性等，且已初步总结获得了ADC及组成部分对安全性和/或有效性贡献的暴露-效应数据，经充分评估后，可考虑在后期临床研究中对ADC某个或某几个组成部分减少或不予检测。如：若ADC的抗体仅用于充当载体递送游离载荷，并且已有可靠研究结果显示总抗体浓度与ADC浓度高度相关，则可考虑不对总抗体进行定量检测。

考虑作用机制及研究目的，在部分独立的临床药理学研究中对生物分析有一定特殊考虑^[1,8,16-17]：（1）对于肝/肾功能不全人群研究，应检测ADC、游离载荷和药理学活性代谢物。如果抗体亦发挥作用机制，还应检测总抗体。（2）对于校正QT间期（QTc）评估，通常仅需检测游离载荷及药理学活性代谢物（如有）。（3）对于药物-药物相互作用（DDI）研究，可基于灵敏度足够的生物分析方法对游离载荷及其药理学活性代谢物进行检测。但是，如果抗体预期以抑制剂、诱导剂或底物的形式参与DDI，建议同时检测ADC或总抗体。（4）对于药动学可比性研究（例如，对于生产工艺变更、处方变更前后产品），应对ADC及各组成部分的浓度进行检测。

稳健的生物样品分析方法是获知ADC及各组成成分行为信息的前提。ADC的生物分析方法具有一定的复杂性，在进行药动学样品生物分析前，需要根据ADC的组成、理化特性、体内代谢情况以及对检测灵敏度和线性范围的要求等因素，选择和建立合适的生物分析方法^[18-20]。对于拟在药品上市注册申报资料中提供的分析数据，相应分析方法应经过充分考察，建议参照ICH《M10：生物分析方法验证及样品分析》相关要求^[21]进行方法学验证及生物样品分析。

值得一提的是，肿瘤细胞膜上的靶标蛋白可能会因酶切割、细胞凋亡等原因脱落进入血液循环。这些脱落靶标亦可能与抗体结合形成复合物，消耗药物并降低疗效。故当抗体靶标脱落至体循环并具有临床意义时，应开发可靠的生物分析方法，对循环中与脱落靶标结合的ADC和未与脱落靶标结合的ADC加以区分。

3.1 DAR值

对于DAR值及DAR值分布，可以采用疏水作用色谱法-紫外检测（HIC-UV）方法以及液相色谱质谱联用（LC-MS/MS）等方法^[9-10]。尤其是随着技术发展，可充分利用液相色谱-高分辨质谱（LCHRMS）在蛋白分析方面的优势^[10]。

3.2 小分子载荷及其代谢物

小分子载荷及其代谢物的全身暴露可能较低，故其生物分析方法应足够灵敏，足以反映可能具有临床意义的全身暴露的微小变化。对于结合型载荷、游离型载荷以及载荷相关代谢产物的检测，一般采用LC-MS/MS方法^[8-9]。

3.3 总抗体及ADC

对于总抗体和ADC，目前采用较多的分析方法为酶联免疫吸附（ELISA）和液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）方法^[7-8,16]。

LC-MS/技术是将液相色谱（LC）的高效分离能力与质谱（MS）强大的鉴定和定量能力相结合的分析技术。随着接口技术［从热喷雾电离到电喷雾电离（ESI）/大气压化学电离（APCI）］、质谱技术（从四极杆到Orbitrap高分辨）和液相技术［（从高效液相色谱（HPLC）到超高效液相色谱（UPLC）］三要素的发展，LC-MS成为了现代分析科学的不可或缺的工具。随着超高效液相色谱-电喷雾-高分辨质谱（UPLC-ESI-HRMS）的发展，以及亲和捕获技术等在LC-MS中的应用，该技术已经成为生命科学、生物医药等领域不可或缺的大分子分析工具。采用LC-MS可以实现分析抗体、小分子载荷以及两者的偶联比例和位点的分析，这是其他技术难以实现的。其具有高特异性和高灵敏度、高通量、无需特定抗体等优点，而且可以提供详细的结构信息，但该技术的应用依然面临一定挑战，如样品前处理复杂、数据分析复杂、设备成本高，对操作人员有一定要求等。

ELISA方法是一种基于抗原-抗体特异性结合反应，并利用酶标记物进行放大和显色，从而对目标物进行定性和定量分析的经典生物化学技术。根据结合过程，ELISA法可以分为直接法、间接法、夹心法、竞争法等。ELISA法具有高灵敏度（pg·mL^-1级别）、高特异性、高通量、操作简便、成本较低、结果直观等特点。但该方法需要高质量、高特异性的捕获抗体-检测抗体对，若抗体特异性不高，可能导致假阳性结果。测定过程相对耗时繁琐，且定量范围受限、可能存在钩状效应。另外ELISA方法获得信息较为单一，不能直接提供ADC药物的DAR信息。

总体而言，ELISA法利用抗体的特异性进行靶向检测，适用于已知目标物的高通量、低成本筛查和定量。LC-MS利用物理化学性质进行分离和鉴定，更适用于未知物探索、多组分同时分析、结构鉴定以及没有合适抗体时的精确定量。两者和其他药效学指标的检测方法共同构建了ADC药物研发中的主要检测技术体系。

3.4 免疫原性

对于抗药抗体和中和抗体的测定，常用的有ELISA方法，电化学发光法（MSD）等^[8-10,15]。

3.5 其他检测

对于开展放射性标记物质平衡研究的生物分析，通常需要使用放射性和非放射性的分析方法。对于生物样品的放射性分析，可使用放射性计数技术进行定性、定量分析，例如：液体闪烁计数（LSC）、加速器质谱（AMS）、HPLC串联放射性检测器等，并应对方法的准确性和可靠性进行确认^[22]。对于药效学指标和/或生物标志物，可根据相关指标的具体特点采用相应的生物样品分析方法。如对于Trop2靶点蛋白，其表达水平与肿瘤的侵袭性和转移呈正相关，其检测可采用全自动免疫组织化学法等。

维泊妥珠单抗（POLIVY优罗华）由罗氏制药研发，通过其中靶向CD79b蛋白的单克隆抗体，将细胞毒性的小分子载荷单甲基澳瑞他汀E（MMAE，C39H67N5O7）递送至肿瘤细胞，抑制癌细胞生长，主要用于治疗复发或难治性弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL），于2019年在FDA首次获批上市^[8]。药物DAR值为3～4。

该药物中的载荷MMAE已在ADC中广泛应用，具有高活性、靶向性和旁观者效应，可显著提升肿瘤治疗的精准性和疗效。已有研究结果表明该物质化学结构稳定，在血浆、肝溶酶体等环境中不易降解。MMAE主要经肝脏代谢，通过胆汁分泌和粪便排泄，部分经尿液排出，且其代谢产物活性较低。综合上述特点，在其临床前和临床研究中，针对游离及结合的MMAE原型进行了密切跟踪分析。

4.1 分析策略

临床前进行了药理学、药动学/毒代动力学、一般毒性、遗传毒性、致癌性、生殖毒性等研究，上述研究中检测了抗体、ADC、MMAE以及代谢物，并描述了各自药动学特征。

本品注册申报时开展了4项临床研究，对抗体、ADC以及游离MMAE进行了测定。基于相关数据获得了药动学特征，并进行了定量药理学分析。

临床前还开展药理药效研究以及分布、代谢/消除研究。

4.2 分析方法

本品药物开发中使用了多种分析方法，对于抗体、总抗体以及ADC，使用或者交叉使用了ELISA方法、免疫亲和LC-MS方法；对于偶联或者游离的MMAE，采用LC-MS/MS方法进行检测^[2,8]。

4.2.1 ADC及相关成分的定量分析

（1）ELISA方法测定抗体和ADC：抗体（游离及偶联状态，即总抗体）以及ADC浓度采用半均相测定法（SHA）测量，使用人或食蟹猴的15个氨基酸肽链捕获目标待测物，并使用连有辣根过氧化物酶（HRP）的生物素化羊抗人Fc抗体进行检测。

（2）免疫亲和LC/MS方法测定抗体和ADC：临床前和临床试验阶段，采用了LC-MS方法测定维泊妥珠单抗和/或ADC中的抗体。首先在96孔板中对血浆中的维泊妥珠单抗和ADC内标物进行抗体特异性的免疫亲和捕获并进行富集。用木瓜蛋白酶消化固定的ADC，释放游离的MMAE和内标分析物，随后用500 μL的乙醇-水（体积比70∶30）进行洗脱。将洗脱液用50 ℃的氮气流挥干，将得到的固体用50 μL的水溶解。该样品使用500 μL的乙腈/甲醇（体积比为70∶30）进行蛋白沉淀，取其上清液用50 ℃的氮气流挥干，再用250 μL的甲醇/水/甲酸（体积比50∶50∶0.1）溶解。使用LC-MS/MS正离子电喷雾模式对最终提取物定量分析。其中MMAE定量离子对为m/z718.7/152.2，MMAF IS定量离子对为m/z 732.7/170.2。该方法定量范围为0.5～50.0 nmol·L⁻¹。

（3）LC-MS/MS方法测定MMAE：偶联状态的MMAE，采用亲和捕获方法捕获ADC后用酶切方法释放MMAE，而后采用LC-MS/MS方法进行测定。游离MMAE，临床前阶段通过固相萃取（血浆）或液-液萃取（尿液和粪便匀浆）从生物基质中提取游离MMAE，再使用LC-MS/MS法测定。临床阶段人血浆中的游离MMAE则采用蛋白沉淀提取。取部分上清液用40 ℃的氮气流挥干，后用水/甲酸（体积比100∶0.1）复溶。使用经验证的LC-MS/MS正离子电喷雾模式对提取物进行分析。该方法定量范围为0.0359～17.9000ng·mL^-1。

4.2.2 抗药抗体的定量分析

采用配体结合试验平台，对本品抗药抗体进行测定。其中临床前研究显示，在抗药抗体（ADA）阳性和ADA阴性的动物中，ADC的暴露并无明显影响。

4.2.3 其他

药理药效学实验：开展了与靶标CD79b的结合力实验、Fcγ受体的结合力实验等，采用了结合或竞争结合的方法，用流式细胞仪进行检测。以及放射性标记的竞争结合实验，并测定其中的放射性信号。

分布研究：单次iv给予125I或DOTA-111In标记抗体的ADC或维泊妥珠单抗抗体，在给药后14 d内多个时间点收集血液及器官组织。所有样品均使用γ-计数器进行分析，少数血浆样品同时采用在线SEC-HPLC-放射性探测器检测。

组织分布和消除代谢研究：给予维泊妥珠单抗[3H]MMAE，通过液闪计数器来测量血液或组织匀浆的放射性，并采用LC-MS或者LC-MS/MS进行检测，以获知其代谢和消除。

由于ADC药物相对复杂的结构、体内作用过程和存在形式，以及小分子载荷相关的安全性风险，所以恰当、准确可靠的分析表征方法和分析策略对其研发至关重要。本文结合国内及国际监管机构审评技术要求，介绍了ADC药物生物样品分析常用的分析手段，阐述了ADC药物各个研发阶段的分析策略及重点，旨在为ADC药物研发中合理开展生物样品分析，提供必要的数据基础提供建议。近年来，随着科学技术的发展，其他偶联药物，如蛋白偶联药物、抗体放射性偶联药物、多肽偶联药物、核酸偶联药物等也在不断得到开发并取得进展^[23]，本文所述的生物样品分析策略和分析技术也可为上述偶联药物提供参考。

中科新生命

  生物医药CMC药学质量研究专家 

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