JBC项目文章 | 犹素化修饰位点检出创新高！杭师大团队优化核心方法，实现人源细胞犹素化底物鉴定新突破！

由泛素（Ubiquitin）及泛素样蛋白（UBL）介导的翻译后修饰在细胞内多种关键生物过程中发挥核心调控作用，其中犹素化（UFMylation）是一种以UFM1为核心、进化保守的UBL修饰系统。类似于泛素化（Ubiquitination），犹素化过程通过UBA5–UFC1–UFL1/DDRGK1/CDK5RAP3构成的E1–E2–E3级联反应将UFM1共价连接到底物赖氨酸残基上。UFM1的成熟及去修饰过程则由UFM1特异性蛋白酶（UFSPs）催化完成。

犹素化失调与癌症及多种发育缺陷密切相关，但其功能机制研究受到已鉴定底物数量极少这一关键瓶颈的限制。目前已报道的犹素化底物不足30个，远低于其他成熟的泛素样修饰系统（如泛素化或SUMO化）所鉴定的底物数量。造成这一现状主要源于两方面的技术挑战：首先，核糖体蛋白L26（RPL26）是细胞内最主要的犹素化底物，RPL26-UFM1缀合物占据了细胞内大部分UFM1，从而在使用抗UFM1抗体检测时掩盖了低丰度底物的信号；其次，传统的犹素化检测方法通常需要共转染多个犹素化相关组分，操作复杂、重复性差，且在富集修饰肽段方面特异性不足。因此，为了解决这些局限性，研究者开发了一种系统的策略来改进犹素化修饰蛋白检测，并实现对底物的大规模识别。

一、构建双敲除细胞系，奠定实验基础

早期研究认为UFSP2是唯一介导pro-UFM1成熟及去UFMylation的蛋白酶，但该研究团队证实了UFSP1同样具有关键酶活性。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建UFSP2单敲除及UFSP1/UFSP2双敲除HEK293T细胞系，结果显示UFSP2单敲除后，细胞内犹素化水平显著升高，出现大量RPL26-UFM1结合物；双敲除可完全阻断犹素化并导致游离UFM1积累。该双敲除细胞系为后续研究提供了理想模型。

二、双敲除细胞系提升检测效率，确认为最优模型

研究以三种已报道的犹素化底物（ASC1、RPL26、p53）为研究对象，对比野生型（WT）、单敲除、双敲除细胞系的修饰检测效果：向各细胞系转染FLAG标签底物与成熟型UFM1∆C2（成熟的UFM1,可直接参与修饰），通过免疫沉淀结合Western Blot检测。结果表明：UFSP2单敲除细胞中，底物修饰信号增强，但外源底物表达量降低；而双敲除细胞中，修饰信号最强，可检测到更多的多聚UFM1修饰产物，且外源底物表达量与野生型无差异，避免了蛋白表达差异的干扰。该研究结果证实了双敲除细胞系是研究犹素化的最优模型。

三、E3连接酶复合物组分UFL1/DDRGK1是核心调控因子

传统方法检测犹素化修饰蛋白需共转染多个组分，操作繁琐。因此，该研究团队在双敲除细胞系中开展单因素实验，逐一分析各组分对犹素化水平的影响。关键结果显示：仅转染UFM1∆C2（成熟的UFM1,可直接参与修饰）可恢复修饰水平；转染混合物中UBA5或UFC1的存在与否对修饰水平无显著影响；但UFL1和DDRGK1的外源性表达对修饰水平起着重要作用，UFL1或DDRGK1的缺失导致修饰水平显著降低。该结果首次明确UFL1和DDRGK1是核心调控因子，并简化了转染体系。

四、HEK293T细胞中犹素化底物的大规模鉴定

使用犹素化基序富集试剂盒（杭州微米生物；货号：WM302）对双敲除细胞系且转染了UFL1+DDRGK1+UFM1∆C2的HEK293T细胞进行特异性修饰肽段富集，并结合LC-MS/MS开展大规模犹素化底物鉴定（犹素化修饰组学由中科新生命提供技术服务）。结果共鉴定出600多个犹素化修饰底物，超1000个修饰位点，底物数量较此前提升20倍以上。随后研究选取了五种代表性蛋白（HSP90α、YEATS2、ANXA5、ANXA6、PRMT5）进行进一步验证，发现所有候选蛋白都可被UFM1修饰且能被UFSP2去修饰。

基序分析发现，靶向UFM1偶联的赖氨酸残基相邻位置的甘氨酸（G）和酪氨酸（Y）残基高度保守，为开发位点预测工具奠定了基础。亚细胞定位结果表明底物主要定位于细胞质和细胞膜上。功能注释分析表明，底物主要参与多种细胞途径，包括翻译、核糖体结构和生物合成、细胞内运输、分泌和囊泡运输等。

本研究实现多项技术突破：

中科新生命联合杭州微米生物推出多个创新修饰组学，助力科研突破，欢迎感兴趣的老师进一步咨询。

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