离心收集类器官样本,放培养基里面常温24h内运输(推荐高铁快运)到APT公司即可。
样本本身为为风险样本, 样本本身细胞量比较少,如果再比较关注中性粒细胞可能细胞量更少甚至没有关注的细胞类型,不建议进行单细胞转录组检测。
可以的,我们已经有椎间盘的项目经验,已经有相关文章见刊,比较困难的点是解离后细胞结团多,细胞数量较少,所以送样量至少400mg来保证单细胞解离的效果。
可以做单细胞测序的,如果老师关注肝实质细胞建议抽核后进行单核转录组,如果老师关注免疫细胞,建议送新鲜组织解离成质量好的单细胞悬液进行后续的实验
有,因为脑组织的固定区域一般较小,需要的组织量比较多,至少1个黄豆粒大小的组织量,小分量解离效果不够理想,神经元细胞活性强体积小的少量被捕获到,如果老师想要得到神经类细胞,可以过70μm的滤网上机,有一定的油包水失败风险,请老师悉知。目前我们有测试过直接上机,目前的上机数据效果还不错,仅供老师参考。
组织量比较少的建议客户提前做一个预实验确认下样本解离效果,评估正式样本能否上机,大分量的可以直接送400mg以上开始正式实验,一般需要看样本的钙化程度、纤维化程度等,送样量要求200mg起
线粒体基因比例高,通常意味着细胞活性低,这种情况下需要进行线粒体基因过滤。并不是所有项目都会进行线粒体基因过滤,视样本情况而定。大多占比大于20%或30% 的时候会进行这一步骤,有的会高达50%才进行。
细胞捕获数与上机样本细胞活性、细胞数量、细胞结团等质控指标密切相关。一般建议捕获5000-10000细胞,更多的细胞可以少量提升基因检出数。基因检出数与样本状态有关,不同的类型样本,基因检出数也可存在数倍的差异。
通常我们细胞类型注释有两种思路,一种是利用软件自动注释,如SingleR等,但一般自动注释的结果只能作为参考;二是基于文献、数据库或研究背景知识等进行人工注释,专业的人工注释通常被认为是细胞注释的金标准,但其过程是极为耗时和缓慢的,并可能是主观的。这两种方法并不是独立割裂开来的,需要搭配使用,软件自动化细胞注释方法方便且系统化,完全依赖于参考数据集,注释的结果有时也并不是高置信度注释。在数据库自动注释的基础上,再提供对应细胞群/亚群的marker基因列表,如T细胞:CD4、CD8,可以根据已发表的文章(物种、疾病、组织检索)或者cellmarker数据库进行进一步的人工注释校正,可大大提高注释的准确度。中科可以提供以上两种不同的注释方法给老师来选择!
如果没有相应组织类型marker基因,可以通过搜集文献整理同源物种marker基因进行手动注释,或者直接根据测序数据鉴定的显著性高表达基因、GO/KEGG富集功能、时间状态及表面抗体来命名细胞类型,所以没有研究过的物种或者没有明确marker基因一样都是有迹可循进行细胞鉴定分析。
搜索marker基因目的是为了细胞降维分群后进行细胞注释鉴定细胞类型。